蛋白质染料间接测量的两种测定方法 双缩脲法和BCA法

【仪器仪表网 专题推荐】现在，我们来介绍蛋白质染料间接测量中的另外两种测定方法，双缩脲法和BCA法。

双缩脲检测法

双缩脲检测法通常用于确定生物样品中的总蛋白质。该测定法可定量浓度范围为0.5至约10mg/mL的蛋白质。干扰物质为铵盐、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和能增强颜色的还原剂二硫苏糖醇。在zui大540 nm下的吸光度测量样品以确定数量。

原理：

双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时(多肽)，带两个以上肽键的肽在含有酒石酸钾钠的碱性介质中与铜离子形成紫色螯合物。紫色颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。

仪器及配件：

• UV7分光光度计(ME-30254726)

• CuvetteChanger自动多联池 (ME- 30236313)

• Rainin移液器

100 - 1000μL (ME-17011782)

10 - 100μL (ME-17011781)

500 - 5mL (ME-17011790)

• 10 mL 玻璃试管

• 一次性1cm光程比色皿

试剂：

• 蛋白质标准品溶液(50 mg / mL)

• 双缩脲试剂

• 蛋白质样品1和2

结果：

标准曲线的绘制：

540nm处的吸光度与蛋白质标准品的浓度制作的标准曲线图

通过上面的结果可以看到，在UV7分光光度计上进行双缩脲测定时，在10mg/200 μL以下时，BSA标准曲线的决定系数R2为0.999，测试的两个蛋白质样品的Srel分别为0.32 %和 0.33 %，这说明测量值有较好重复性;回收率分别高达为100.8%和97.6 %。

二喹啉甲酸(BCA)检测法

二喹啉甲酸(BCA)检测法用于生物样品中总蛋白浓度的比色检测和定量，是Lowry测定法的一种改进方法。BCA蛋白测定法适用于含有zui高5%去污剂(表面活性剂)的样品。此外，该蛋白质测定法的优点是操作简单，相对稳定的有色络合物，可调节温度实现不同的灵敏度。

原理：

反应的di一步，在碱性溶液中通过肽键将Cu2+离子还原为Cu+离子。被还原的Cu2+量与溶液中存在的蛋白质量成正比。其次，两个带有一个亚铜阳离子(Cu+)与BCA分子形成螯合，因此颜色变成了紫色，并在562 nm处进行测量，紫色颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。

仪器和配件：

• UV7分光光度计(ME-30254726/30254729)

• CuvetteChanger自动多联池 (ME-30236313)

• Rainin移液器

100 - 1000 μL (ME-17011782)

500 - 5 mL (ME-17011790)

• 10 mL 玻璃试管

• 一次性1cm光程比色皿

试剂：

• 蛋白质标准品BSA(2 mg / mL)

• BCA试剂A

• BCA试剂B

结果：

标准曲线的绘制：

562nm处的吸光度与蛋白质标准品的浓度制作的标准曲线图

通过上面的结果可以看到，在UV7分光光度计上进行BCA法测量时，在250 μg/mL以下时，BSA标准曲线的决定系数R2为0.999，Srel为0.289%，表明测量结果有较好重复性;回收率高达97.8%。